了解一下該如何培養(yǎng)質(zhì)粒吧

 　　在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。人工構(gòu)建的質(zhì)?？梢约喾N有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點(diǎn)、抗生素耐藥性等。常用的人工質(zhì)粒運(yùn)載體有pBR322、pSC101。

　　pBR322含有抗四環(huán)素基因(Tcr)和抗氨芐青霉素基因(Apr)，并含有27種限制性?xún)?nèi)切酶的單一識(shí)別位點(diǎn)。如果將DNA片段插入EcoRI切點(diǎn)，不會(huì)影響兩個(gè)抗生素基因的表達(dá)。

　　但是如果將DNA片段插入到Hind Ⅲ、Bam H I 或 Sal I切點(diǎn)，就會(huì)使抗四環(huán)素基因失活。這時(shí)，含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細(xì)菌抗氨芐青霉素，但對(duì)四環(huán)素敏感。

　　沒(méi)有DNA插入片段的pBR322會(huì)使宿主細(xì)菌既抗氨芐青霉素又抗四環(huán)素，而沒(méi)有pBR322質(zhì)粒的細(xì)菌將對(duì)氨芐青霉素和四環(huán)素都敏感。pSC101與pBR322相似，只是沒(méi)有抗氨芐青霉素基因和PstI切點(diǎn)。

　　質(zhì)粒運(yùn)載體的大插入片段約為10 kb(kb表示為千堿基對(duì))。

　　1973年，科學(xué)家將質(zhì)粒作為基因的載體使用，為基因工程的誕生奠定了基礎(chǔ)。

　　常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒。這種質(zhì)粒常含有抗生素抗性基因，例如，卡那霉素抗性基因。

　　pBR322質(zhì)粒DNA分子的長(zhǎng)度為4361bp*(*Sequencing data from Watson (confirmed at New England Biolabs, Inc.) has shown pBR322 to be 4,361 base pairs, not 4,363 base pairs as previously reported.)，此載體中有兩個(gè)標(biāo)記基因，一個(gè)是氨芐青霉素抗性基因(Apr)，另一個(gè)是四環(huán)素抗性基因(Tetr)。已知pBR322DNA分子共有24種核酸內(nèi)切限制酶的單一識(shí)別位點(diǎn)。

　　其中7種限制酶(從12:00位置按順時(shí)針?lè)较?即EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、XmaⅢ和NruI的識(shí)別位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，另外有2 種限制酶即ClaI和HindⅢ的識(shí)別位點(diǎn)是存在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，在這9個(gè)限制位點(diǎn)上插入外源DNA都會(huì)導(dǎo)致tetr的失活。

　　3種限制酶即ScaI、PvuI和PstI的識(shí)別位點(diǎn)位于氨芐青霉素抗性基因內(nèi)，在這些位點(diǎn)插入外源DNA則會(huì)導(dǎo)致ampr基因的失活。由質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)可知其具有如下優(yōu)點(diǎn):

　?、啪哂休^小的分子量。經(jīng)驗(yàn)表明，為了避免在DNA的純化過(guò)程中發(fā)生鏈的斷裂，克隆載體的分子大小好不要超過(guò)10Kb。pBR322質(zhì)粒這種小分子量的特點(diǎn)，不僅易于自身DNA的純化，而且可容納較大的外源DNA片段;

　　⑵具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)，能指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞以及外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。

　　標(biāo)記基因往往可以賦予宿主細(xì)胞一種新的表型，這種轉(zhuǎn)化細(xì)胞可明顯地區(qū)別于非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。當(dāng)我們把一個(gè)DNA片段插入到某一個(gè)標(biāo)記基因內(nèi)時(shí)，該基因就失去了相應(yīng)的功能。

　　當(dāng)把這種重組DNA分子轉(zhuǎn)到宿主細(xì)胞后，該基因原來(lái)賦予的表型也就消失了。要是仍保留了原來(lái)表型的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)含有的DNA分子一定不是重組子。很顯然，既要指示外源DNA是否進(jìn)入了宿主細(xì)胞，又要指示載體DNA分子中是否插入了外源DNA片段，那么這種載體必須至少具有兩個(gè)標(biāo)記基因。

　　另外，pBR322質(zhì)粒載體還具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞中可積累1000~3000個(gè)拷貝，這就為重組體DNA的制備提供了極大的方便。